Bei kultiviertem Fleisch, auch als Zellkulturfleisch oder Laborfleisch bezeichnet, werden Stammzellen in Bioreaktoren zu Muskelzellen differenziert. Diese Zellen wachsen auf einem Gerüst, das dem von Tierfleisch ähnelt. Ziel ist es, die Beschaffenheit, den Geschmack und das Aussehen von tierischem Fleisch zu imitieren und möglicherweise die mit der herkömmlichen Fleischproduktion verbundenen Probleme in Bezug auf Ressourcen, Umwelt, Gesundheit und Ethik zu verringern.

Wissenschaftler arbeiten an der Entwicklung, aber für eine groß angelegte Produktion werden kostengünstige rekombinante Proteine und Wachstumsfaktoren benötigt. CUSABIO verfügt über mehr als 16 Jahre Erfahrung mit rekombinanten Proteinen und arbeitet mit Herstellern von kultiviertem Fleisch zusammen, um die Herausforderungen der Branche zu bewältigen und zur Entwicklung beizutragen.

Bei der Herstellung von Zellkulturfleisch wird in der Regel eine Reihe von Wachstumsfaktoren und Nährstoffen zugesetzt, um das Zellwachstum, die Differenzierung und die Gewebebildung zu fördern. Diese Wachstumsfaktoren können die Zellproliferation, die Differenzierung und die Bildung der erforderlichen Gewebestruktur fördern.

CUSABIO bietet eine Reihe von Wachstumsfaktoren und verwandten rekombinanten Proteinen an, die in der Forschung und der Produktion von Zellkulturfleisch verwendet werden können. Dazu gehören IGF-1, FGF, bFGF, TGF-β, IGF, BMP und weitere, die mehrere Tierarten wie Huhn, Schwein, Rind, Fisch und andere abdecken.

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In diesem Whitepaper werden die neuesten Erkenntnisse über die molekularen Mechanismen der Nekroptose im Zusammenhang mit rezeptor-interagierenden Proteinkinasen (RIPK) vorgestellt und Beispiele für den Kaninchen-Antikörper gegen RIPK3 (Cat #: 2283) von ProSci bei der Analyse der Expression von RIPK3 in verschiedenen Zelllinien mittels Western Blot gegeben.

ProSci verfügt über mehr als 25 Jahre Erfahrung in der Entwicklung von qualitativ hochwertigen rekombinanten, monoklonalen und polyklonalen Single-Domain-Antikörpern der variablen schweren Domäne der schweren Kette (VHH). Darüber hinaus bieten unsere kundenspezifischen Antikörperdienste die Flexibilität, die Entwicklung und Produktion von Antikörpern für nahezu jeden Bedarf anzupassen.

„RIPK3 und MLKL: Wesentliche Akteure bei IFN-γ-induzierter PS-Exposition und Nekroptose“

Die 2019 veröffentlichte Arbeit von Chen et al. mit dem Titel „Interferon induces the cell surface exposure of phosphatidylserine (PS) by activating the protein MLKL in the absence of caspase-8 activity“ präsentiert Forschungsergebnisse über die Rolle von RIPK3 bei der IFN-γ-induzierten PS-Exposition in embryonalen Fibroblasten der Maus (MEFs). Die Autoren zeigten, dass RIPK3 für die PS-Exposition in MEFs notwendig ist. Gleichzeitig ist die RIPK3-aktivierte Oligomerisierung des MLKL-Proteins (mixed lineage kinase domain-like protein) wesentlich für die IFN-γ-induzierte PS-Exposition und die Durchführung des nekroptotischen Zelltods in MEFs (1).

Die Nekroptose ist eine nicht-apoptotische, regulierte Form der Nekrose, die durch Auslöser wie den Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) ausgelöst wird, der an seine Rezeptoren bindet (2). Sie erfordert die Aktivität von RIPK1 und RIPK3 und wird durch die Aktivierung von MLKL vermittelt. (3) Interferon (IFN) wird in zwei Gruppen eingeteilt, Typ I und Typ II, und beide Arten von IFN induzieren die Expression von Hunderten von spezifischen Genen (4,5).

In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass RIPK3 für die IFN-γ-induzierte PS-Exposition und Nekroptose in RIPK3-rekonstituierten iC8KO MEFs, immortalisierten Caspase-8-Knockout (iC8KO)-Mausembryonalfibroblasten mit exogen exprimiertem RIPK3, notwendig ist und dass MLKL in IFN-γ-behandelten MEFs vor der Nekroptose phosphoryliert und oligomerisiert wird. Darüber hinaus hängen die IFN-γ-induzierte PS-Exposition und Nekroptose in verschiedenen Zellen von RIPK1, RIPK3 und MLKL ab.

Diese Forschung unterstreicht die Rolle von RIPK3, MLKL und IFN-γ bei der Auslösung von PS-Exposition und Nekroptose in MEFs und bietet Einblicke in die Mechanismen, die der IFN-γ-induzierten PS-Exposition zugrunde liegen, sowie in die möglichen Funktionen von MLKL in diesem Prozess. Unterstützt durch den Einsatz des Kaninchen-Antikörpers gegen RIPK3 von ProSci könnten diese Erkenntnisse zur Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für die gezielte Bekämpfung der Nekroptose bei Krankheiten wie Krebs und Infektionen führen.

„Auswirkungen der RIPK1 K45A-Mutation auf Nekroptose, Zytokinsignalisierung und Immunantwort: Eine veränderte Landschaft der Entzündungs- und Infektionsanfälligkeit“

Die 2016 von Shutinoski et al. veröffentlichte Arbeit mit dem Titel „K45A mutation of RIPK1 results in poor necroptosis and cytokine signaling in macrophages, which impacts inflammatory responses in vivo“ untersuchte die Rolle der Kinase-Domäne von RIPK1 bei der Nekroptose und Zytokin-Signalisierung in Makrophagen und die daraus resultierenden Auswirkungen auf die Entzündungsreaktion in vivo. Außerdem wurde die Wirkung einer K45A-Mutation von RIPK1 auf die Nekroptose von Makrophagen und die Aktivierung der Entzündungsreaktion untersucht (7).

RIPK1 ist für die Induktion der Nekroptose unerlässlich und wird durch die Aktivierung verschiedener Toll-like-Rezeptoren (TLRs) und Zytokinrezeptoren ausgelöst (8,9). Die Phosphorylierung von RIPK1 führt zur Interaktion von RIPK1 und RIPK3, die für die Nekroptose notwendig ist (10). RIPK3 kann in bestimmten Fällen die Nekroptose auch unabhängig von RIPK1 auslösen (11). Darüber hinaus ist auch das MLKL-Protein für die Nekroptose unerlässlich, da seine Phosphorylierung zu seiner Oligomerisierung und Verlagerung zur Zellmembran führt, wodurch die zelluläre Integrität gestört wird (12). Somit spielen die Proteine RIPK1 und MLKL durch ihre jeweiligen Interaktionen und Phosphorylierungen eine wichtige Rolle bei der Auslösung der Nekroptose.

In ihrer Studie verwendeten die Autoren den RIPK1^K45A-Mäusestamm, um die entscheidende Rolle der RIPK1-Kinase-Aktivität bei der Erleichterung der Makrophagen-Nekroptose zu klären. Bei ihren Untersuchungen stellten sie fest, dass die RIPK1^K45A-Mutation zu einem Rückgang der Zytokinproduktion, einer Verringerung der Phosphorylierung von RIPK1- und MLKL-Proteinen und einer Erhöhung der Zellüberlebensrate nach Behandlungen mit einer Kombination aus Lipopolysaccharid (LPS) und einem zellpermeablen Pan-Caspase-Inhibitor (zVAD) sowie Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNFα) und zVAD führte. Die LPS/zVAD-Behandlung wurde eingesetzt, um Nekroptose in Makrophagen auszulösen, wobei die Makrophagen LPS zusammen mit zVAD ausgesetzt wurden. Bei der TNFα/zVAD-Behandlung wurde TNFα, ein Entzündungszytokin, in Verbindung mit zVAD verabreicht, um die Nekroptose in Makrophagen auszulösen.

Darüber hinaus entdeckten die Forscher den regulierenden Einfluss von RIPK1 auf die TNFα-Signalgebung und seine Beteiligung an der Transkriptionsregulation von Makrophagen-Entzündungsprotein-1 alpha (MIP-1α) und Interleukin-1 alpha (IL-1α). Darüber hinaus machten die Forscher die faszinierende Beobachtung, dass Caspase-8-Inhibitoren das Auftreten von Nekroptose in Makrophagen verstärkten, insbesondere wenn der p38MAPK-Signalweg unterdrückt wurde.

Diese Studie zeigte, dass Lysin-45 von RIPK1 für die Auto-Phosphorylierung von RIPK1 und den Zelltod von Makrophagen erforderlich ist, der durch verschiedene Stimuli, einschließlich LPS und TNF-α, ausgelöst wird. RIPK1K45A-Makrophagen waren resistent gegen den durch diese Stimuli ausgelösten Zelltod und zeigten eine verminderte Phosphorylierung von STAT1 als Reaktion auf LPS/ZVAD- und TNF-α/ZVAD-Behandlungen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass RIPK1K45A an der Regulierung des Zelltods nach der TNF-R-Bindung beteiligt ist und eine Rolle bei der Verhinderung eines übermäßigen Zelltods als Reaktion auf verschiedene Stimuli spielt.

Die Studie zeigte, dass die Phosphorylierung von RIPK3 in RIPK1K45A-Makrophagen abgeschwächt war, was auf die wichtige Rolle dieser Kinasedomäne bei der Förderung der Makrophagen-Nekroptose hinweist. Der RIPK3-Antikörper wurde zur Identifizierung und Messung des RIPK3-Spiegels sowie seiner Interaktion mit RIPK1 und MLKL mittels Western Blot verwendet. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass der RIPK3-Antikörper für die Charakterisierung der RIPK1-Kinase-Aktivität und ihrer Rolle bei der Regulierung der Nekroptose, der Entzündungsreaktion und der Zytokin-Signalgebung in Makrophagen von wesentlicher Bedeutung war.

Schlussfolgerung

Diese Untersuchungen geben wichtige Einblicke in die Rolle von RIPK3, MLKL und IFN-γ bei der Initiierung der Phosphatidylserin-Präsentation und Nekroptose in embryonalen Fibroblasten der Maus (MEFs). Darüber hinaus unterstreicht sie die entscheidende Rolle von RIPK3 und MLKL bei der IFN-γ-vermittelten Phosphatidylserin-Präsentation und dem Nekroptose-Signalweg.

Darüber hinaus behindert eine Mutation in RIPK1, insbesondere RIPK1K45A, die Nekroptose von Makrophagen und die Auslösung der Entzündungsreaktion. Diese Forschungsarbeit unterstreicht die Rolle der RIPK1-Kinase-Domäne bei der Initiierung der Nekroptose und der Zytokin-Signalisierung in Makrophagen und die anschließenden Auswirkungen auf die Entzündungsreaktion in vivo.

Der ProSci-Kaninchen-Antikörper gegen RIPK3 wurde in dieser Untersuchung eingesetzt, um die Expression von RIPK3 in verschiedenen Zelllinien zu untersuchen. Er spielt eine entscheidende Rolle bei der Beschreibung der RIPK1-Kinase-Aktivität und ihrer regulatorischen Funktionen bei Nekroptose, Entzündungsreaktionen und Zytokin-Signalen in Makrophagen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen haben das Potenzial, weitere Studien zu den Funktionen von RIPK3 und MLKL im Prozess der Phosphatidylserin-Exposition und der Nekroptose zu erleichtern und damit unser Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen des Zelltods im Immunsystem voranzutreiben, was zur Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur gezielten Bekämpfung der Nekroptose bei Krankheiten wie Krebs und Infektionen führt.

Quellen

1. Chen J, Kuroki S, Someda M, Yonehara S. Interferon-γ induces the cell surface exposure of phosphatidylserine by activating the protein MLKL in the absence of caspase-8 activity. J Biol Chem. 2019 Aug 9;294(32):11994-12006. doi: 10.1074/jbc.RA118.007161. Epub 2019 Jun 19. PMID: 31217278; PMCID: PMC6690710. 
2. Dondelinger Y, Hulpiau P, Saeys Y, Bertrand MJM, Vandenabeele P. An evolutionary perspective on the necroptotic pathway. Trends Cell Biol. 2016 Oct;26(10):721-732. doi: 10.1016/j.tcb.2016.06.004. Epub 2016 Jun 28. PMID: 27368376. 
3. Cho YS, Challa S, Moquin D, Genga R, Ray TD, Guildford M, Chan FK. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 2009 Jun 12;137(6):1112-23. doi: 10.1016/j.cell.2009.05.037. PMID: 19524513; PMCID: PMC2727676. 
4. Pestka S, Krause CD, Walter MR. Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors. Immunol Rev. 2004 Dec;202:8-32. doi: 10.1111/j.0105-2896.2004.00204.x. PMID: 15546383. 
5. Borden EC, Sen GC, Uze G, Silverman RH, Ransohoff RM, Foster GR, Stark GR. Interferons at age 50: past, current and future impact on biomedicine. Nat Rev Drug Discov. 2007 Dec;6(12):975-90. doi: 10.1038/nrd2422. PMID: 18049472; PMCID: PMC7097588. 
6. Zargarian S, Shlomovitz I, Erlich Z, Hourizadeh A, Ofir-Birin Y, Croker BA, Regev-Rudzki N, Edry-Botzer L, Gerlic M. Phosphatidylserine externalization, “necroptotic bodies” release, and phagocytosis during necroptosis. PLoS Biol. 2017 Jun 26;15(6):e2002711. doi: 10.1371/journal.pbio.2002711. PMID: 28650960; PMCID: PMC5501695. 
7. Shutinoski B, Alturki NA, Rijal D, Bertin J, Gough PJ, Schlossmacher MG, Sad S. K45A mutation of RIPK1 results in poor necroptosis and cytokine signaling in macrophages, which impacts inflammatory responses in vivo. Cell Death Differ. 2016 Oct;23(10):1628-37. doi: 10.1038/cdd.2016.51. Epub 2016 Jun 3. PMID: 27258786; PMCID: PMC5041191. 
8. Kelliher MA, Grimm S, Ishida Y, Kuo F, Stanger BZ, Leder P. The death domain kinase RIP mediates the TNF-induced NF-kappaB signal. Immunity. 1998 Mar;8(3):297-303. doi: 10.1016/s1074-7613(00)80535-x. PMID: 9529147. 
9. Vandenabeele P, Galluzzi L, Vanden Berghe T, Kroemer G. Molecular mechanisms of necroptosis: an ordered cellular explosion. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010 Oct;11(10):700-14. doi: 10.1038/nrm2970. Epub 2010 Sep 8. PMID: 20823910. 
10. Cho YS, Challa S, Moquin D, Genga R, Ray TD, Guildford M, Chan FK. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 2009 Jun 12;137(6):1112-23. doi: 10.1016/j.cell.2009.05.037. PMID: 19524513; PMCID: PMC2727676. 
11. Upton JW, Kaiser WJ, Mocarski ES. Virus inhibition of RIP3-dependent necrosis. Cell Host Microbe. 2010 Apr 22;7(4):302-313. doi: 10.1016/j.chom.2010.03.006. PMID: 20413098; PMCID: PMC4279434. 
12. Sun L, Wang H, Wang Z, He S, Chen S, Liao D, Wang L, Yan J, Liu W, Lei X, Wang X. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 2012 Jan 20;148(1-2):213-27. doi: 10.1016/j.cell.2011.11.031. PMID: 22265413. 

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Biotium hat sich den Beinamen „Glowing products for science“ zu recht zugelegt. Sie bieten eine Vielzahl von Stains für verschiedene Organellen und Zellstrukturen, die fast keine Wünsche offen lassen.

Live HeLa cells stained with NucSpot Live 650 overnight at 37C and imaged in the Cy® 5 channel.

Zellkern

NucSpot Live 488 und NucSpot Live 650 Nuclear Stains
NucSpot Live Nuclear Stains färben spezifisch den Zellkern in lebenden oder fixierten Zellen an, ohne dass ein Waschen erforderlich ist. NucSpot Live 488 hat eine grüne Fluoreszenz (Ext/Em 500/515 nm), während NucSpot Live 650 eine far-red Fluoreszenz (650/675 nm) zur Detektion im Cy®5-Kanal aufweist. Im Gegensatz zu Draq5 hat NucSpot Live 650 eine niedrige Zytotoxizität und kann für eine längerfristige Bildgebung verwendet werden. NucSpot Live 650 ist auch kompatibel mit superauflösenden Bildgebung durch SIM und STED.

Formaldehyde-fixed, Triton X-100-permeabilized HeLa cells stained with NucSpot Live 488.

RedDot 2 nuclear counterstain (magenta) with CF dye secondary antibodies and CF405M phalloidin.

RedDot 1 und RedDot 2 Far-Red Nuclear Stains
RedDot 1 und RedDot 2 sind far-red nukleäre Gegenfärbungen für den Cy®5-Kanal. RedDot 1 ist eine Alternative zu DRAQ5, das schnell und spezifisch Kerne in lebenden Zellen färbt. Es kann für die Zellzyklusanalyse durch Durchflusszytometrie verwendet werden. Es kann auch für die Zellnormierung für In Cell Western verwendet werden. RedDot 1 zeigt Zytotoxizität innerhalb von wenigen Stunden der Färbung, so dass für die Langzeit-Live-Zell-Bildgebung NucSpot Live 650 empfohlen wird.

RedDot 2 ist membranundurchlässig und kann verwendet werden, um selektiv tote Zellen oder als  Gegenfärbung des Zellkerns für fixierte Zellen. RedDot 2 zeigt eine bessere nukleare Spezifität in fixierten Zellen als DRAQ7, welches einen Blockingschritt für zellkernspezifische Gegenfärbung erfordert.

RedDot 1 (red) in live HeLa. Apoptotic cells are stained with NucView 405 (blue) and CF488A Annexin V (green).

Live-or-Dye NucFix Rot
Live-or-Dye NucFix Red ist ein einzigartiger, zellmembranundurchlässiger Farbstoff, der die Kerne der toten Zellen spezifisch färbt. Der Farbstoff kann in tote Zellen eindringen, die die Membranintegrität beeinträchtigen und den Zellkern kovalent markieren und so eine klare Differenzierung von lebenden und toten Zellen entweder durch Mikroskopie oder Durchflusszytometrie ermöglichen. Im Gegensatz zu anderen üblicherweise verwendeten zellkernspezifischen Färbungen wie Propidiumjodid oder DRAQ7 haftet NucFix kovalent an DNA, so dass die Zellen fixiert und ohne Verlust der Fluoreszenz oder Farbstoff Transfer zwischen den Zellen permeabilisiert werden können.

Klassische blaue Zellkern Färbung
DAPI und Hoechst sind weit verbreitete blau fluoreszierende zellkernspezifische Gegenfärbungen. Sie sind DNA bindende Farbstoffe, die in der Lösung minimal fluoreszierend sind, aber eine starke Fluoreszenzverstärkung bei der Bindung von DNA aufweisen.

DAPI ist weniger membranpermeabel als Hoechst und wird typischerweise verwendet, um fixierte Zellen in Konzentrationen um 1 µg/ml zu färben. Antifade mounting medium mit DAPI, wie die EverBrite Mounting Media von Biotium, kann für ein einstufiges Einbetten und Gegenfärben eingesetzt werden. Das Färben von lebenden Zellen mit DAPI erfordert eine höhere Konzentration (~10 ug/ml). Wir bieten DAPI-Dilactat, ein wasserlösliches DAPI-Salz, das bei höheren Konzentrationen eingesetzt werden kann.

Hoechst-Farbstoffe sind Membranpermeabel und können für lebende oder fixierte Zellfärbung und Zellzyklusanalyse verwendet werden. Hoechst 33342 und Hoechst 33528 werden beide von BrdU-markierter DNA abgemildert und in Zellteilungsstudien eingesetzt. Die beiden Farbstoffe sind spektral ähnlich. Hoechst 33342 ist weitaus zellpermeabler als Hoechst 33258, aber beide Farbstoffe werden üblicherweise als Zellkernfärbemittel für lebende oder fixierte Zellen bei 1 ug/ml verwendet.

Während Hoechst und DAPI weniger Zytotoxizität zeigen als interkalierende DNA-Farbstoffe, binden sie dennoch DNA in lebenden Zellen und sind potentiell gefährlich. Biotium bietet Hoechst 33342, Hoechst 33258 und DAPI als 10 mg/ml Lösungen in Wasser, für mehr Komfort und Sicherheit.

DAPI und Hoechst unterliegen einer Photokonversion durch UV-Anregung, um grüne Fluoreszenzfarbstoffe zu bilden, die zu Artefakten in der Mehrfarben-Bildgebung führen können.

DAPI Färbung – Welche Konzentration?

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„Zellbasierte Assays“: Lassen Sie uns zunächst den Namen in zwei Teile zerlegen:

Assay: Zellbasierte Assays sind Assays. Das bedeutet, dass ihr Zweck darin besteht, etwas nachzuweisen.

Zellbasiert: Während Sie wahrscheinlich mit Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (kurz: ELISA) vertraut sind, die auf dem Nachweis eines Antigens in einer Probe über die Bindung mit einem spezifischen Antikörper beruhen, weisen zellbasierte Assays etwas im Kontext einer Zelle nach.

Okay, machen wir das Ganze etwas einfacher.

Sie haben eine neue Verbindung entdeckt, die auf magische Weise die Vermehrung von Zellen steigert. Nun wollen Sie diese Beobachtung mit wissenschaftlichen Daten untermauern. Dies ist der richtige Zeitpunkt für einen zellbasierten Proliferationstest.

Mit diesem zellbasierten Proliferationstest können Sie die relativen Raten der Zellteilung mit und ohne Ihren magischen Wirkstoff quantifizieren.

Wenn sich dabei herausstellt, dass Ihr Wirkstoff die Zellteilungsrate signifikant erhöht hat, könnten Sie etwas erreichen.

Vor allem im Gegensatz zu Tests wie ELSIA ermöglichen zellbasierte Tests die Untersuchung Ihrer Beobachtung in einem komplexen biologischen System (in situ) und nicht in einer künstlichen Umgebung (in vitro).

Welche Arten von zellbasierten Assays gibt es?

Zellviabilitätstests (Cell Viability Assays) helfen Ihnen, das Verhältnis zwischen lebenden und toten Zellen zu bestimmen.

Ein beliebtes Beispiel ist das Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8).

Ähnlich wie Zelllebensfähigkeitstests helfen Zytotoxizitätstests (Cell Cytoxicity Assays)bei der Bestimmung des Anteils lebender und toter Zellen in einer Population, nachdem diese mit einer Substanz behandelt wurde.

Zellproliferations- (Cell Proliferation Assays) und Zellzyklus-Assays (Cell Cycle Assays) helfen Ihnen bei der Überwachung der zellulären Wachstumsraten einer bestimmten Population.

Zellseneszenz-Assays (Cell Senescence Assays) helfen Ihnen bei der Bewertung der Zellgesundheit.

Zelltod-Assays (Cell Death Assays) sind eine Kategorie von zellbasierten Assays, mit denen sich der Zelltod überwachen lässt. Zu dieser Gruppe gehören Assays zum Nachweis von Apoptose (Programmierter Zelltod Typ 1), Autophagie (Programmierter Zelltod Typ 2) und Nekrose (Programmierter Zelltod Typ 3).

Mit zellbasierten Wirksamkeitstests (Cell-based Potency Assays) lässt sich analysieren, wie „stark“ eine bestimmte Verbindung eine bestimmte Reaktion in einem zellulären Kontext auslöst. Mitglieder dieser Assay-Gruppe werden für die Forschung in den Bereichen Zellmigration, Zellsignalisierung sowie Zellproliferation und -hemmung eingesetzt.

Annexin V ist ein gängiges Ziel für den Nachweis von Apoptose.

TUNEL-Assays (terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling) sind eine weitere Möglichkeit, Apoptose in situ nachzuweisen.

Nein, wir sind noch nicht fertig mit Apoptose-Assays:

Caspase Assay Kits helfen Ihnen, die durch Perforin und Granzyme sowie den Fas/Fas-Liganden-Weg vermittelte Tötung von Zielzellen aufzudecken.

Was ist der Unterschied zwischen einem ELISA und einem zellbasierten Assay?

Während ein ELISA hauptsächlich zu diagnostischen Zwecken eingesetzt wird, dienen zellbasierte Assays dazu, durch In-situ-Experimente kontextbezogene Erkenntnisse zu gewinnen.

Darüber hinaus werden bei einem ELISA spezifische biologische Proben als „Input“-Material verwendet, während bei zellbasierten Assays Zellen und Gewebe überwacht werden und untersucht wird, wie sich Verbindungen auf sie auswirken.

Dies ist auch der Grund, warum zellbasierte Assays für die Arzneimittelentdeckung verwendet werden. Nach dem ersten Screening mit biochemischen Assays und vor dem Einsatz eines Tiermodells ermöglichen zellbasierte Assays das experimentelle Screening der Wirkung einer Substanz auf Zellen und Gewebe innerhalb eines bestimmten physiologischen pH-Werts und anderer Faktoren, die für einen zellulären Kontext spezifisch sind.

Zellbasierte Assays vs. biochemische Assays

Der Unterschied zwischen zellbasierten Assays und biochemischen Assays liegt in ihren Funktionen:

Während biochemische Assays zur quantitativen und qualitativen Analyse von Biomolekülen verwendet werden, dienen zellbasierte Assays zur Bewertung der zellulären Reaktion von Geweben und Zellen auf bestimmte Verbindungen und Arzneimittel.

Weitere interessante Links:

ELISA-Test vs. PCR: Ein Vergleich der Diagnoseverfahren

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Im allgemeinen werden Diagnoseverfahren in der Medizin für die Identifizierung und Behandlung von Krankheiten genutzt. Ob aus der Schule, dem Studium oder dem Labor, sicherlich ist vielen der ELISA-Test und die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) bekannt.

ELISA-Test

Der ELISA-Test (Abkürzung für: Enzyme-linked Immunosorbent Assay) ist ein immunologisches Verfahren.

Der Test dient der Detektion (dem Nachweis) von Antikörpern oder Antigenen in einer Probe. Basis des Nachweises ist das Prinzip der Antigen-Antikörper-Reaktion. Dabei bindet eine spezifisches Antigen mit einem entsprechenden Antikörper, ähnlich wie ein Schlüssel in ein Schloss passt. Zu guter Letzt befindet sich noch ein Enzym im Reaktionsansatz, sodass es zu eine enzymatischen Reaktion kommt, die letztlich die Auswertung des ELSIA ermöglicht. Wichtig hierfür ist die Wahl eines richtigen Verdünnungsverhältnis für den Antikörper.

Obwohl es viele Varianten dieses Ansatzes gibt, sind vier die meist gebräuchlichsten:

• direkter ELISA
• indirekter ELISA
• Sandwich ELISA
• kompetitiver ELISA

Zu den Vorteile eines ELISA-Test zählen die hohe Sensitivität, quantitative Ergebnisse und die Möglichkeit, mehrere Proben gleichzeitig zu analysieren.

Zu den Nachteile eines ELISA-Test zählen hingegen die Notwendigkeit spezifischer Antikörper und die mögliche Kreuzreaktivität mit ähnlichen Antigenen.

PCR

Die PCR (Abkürzung für: Polymerase-Kettenreaktion) ist ein molekularbiologisches Verfahren.

Es dient der (exponentiellen) Vervielfältigung spezifischer DNA-Sequenzen. Charakteristisch für eine PCR sind die thermischen Zyklen, bei denen die DNA-Doppelhelix denaturiert, mit spezifischen Primern hybridisiert und von einem DNA-Polymerase-Enzym amplifiziert wird.

Genutzt wird die PCR u. a. für die Erkennung von genetischen Mutationen, die Identifizierung von Krankheitserregern wie Viren und Bakterien, die Forensik und die genetische Fingerabdruckanalyse.

Zu den Vorteilen der PCR zählen ihr Sensitivität und die Möglichkeit selbst geringen Mengen an DNA nachzuweisen.

Zu den Nachteilen einer PCR gehören Kontaminationen und die Notwendigkeit einer möglichst genauen Kenntnis der Ziel-DNA-Sequenz.

ELISA-Test vs. PCR

Hinsichtlich der Sensitivität und Spezifität gewinnt die PCR: Sie ist oft noch etwas empfindlicher als der ELISA-Test und kann sogar einzelne DNA-Moleküle nachweisen.

Bei den Kosten und der Durchführungszeit gewinnt der ELISA-Test: ELISA-Tests sind in der Regel kostengünstiger und schneller durchzuführen als PCR-Test, für die Wissenschaftler teurere Geräte und längere Laufzeiten benötigen.

Wenn es um die Probentypen geht, gibt es ein klares unentschieden: Während ELISA-Test häufig flüssige Proben benötigen, benötigt die PCR oft eine DNA-Extraktion und -Aufreinigung.

Hier ist zusätzlich ein zentraler Unterschied zu nennen:

ELISA detektieren Antigene (Proteine) oder Antikörper, während eine PCR DNA nachweist.

Außerdem sind die unterschiedlichen Anwendungssituationen zu nennen: Für die Massenuntersuchung von Proben eignet sich ein ELISA-Test in großen Labors. Wenn es darum geht, spezifische genetische Informationen zu identifizieren oder geringe Konzentrationen von DNA nachzuweisen setzt man das PCR-Verfahren ein.

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Es ist preislich so gestaltet, dass die Mikro-CT nicht nur für Mäuse, sondern sogar für Ratten erschwinglich ist. Ein Fläschchen liefert einen klaren Kontrast für drei Mäuse (je 25 g) bei 1 g/kg. Bei einer 250 g schweren Ratte können Sie mit weniger als zwei Fläschchen einen klaren Kontrast bei 0,54 g/kg erzielen.

Merkmale und Vorteile

• VivoVist bietet einen etwa 3-4 Mal höheren Kontrast als kommerzielle mikroCT-Kontrastmittel der Konkurrenz. Eine anfängliche Blutkonzentration von 50 mg/mL (5%) oder 1 g/kg Körpergewicht (ein Drittel einer Ampulle für eine 25 g schwere Maus) ergibt einen Kontrast von mehr als 3500 HU (Hounsfeld-Einheiten).
• Lange Bluthalbwertszeit von 14 Stunden. Das Mittel verbleibt länger im Blutkreislauf als Konkurrenzprodukte. Dies ermöglicht längere Bildgebungszeiten und eine längere Datenerfassung sowie eine längere Diffusion in Tumore und andere interessante Merkmale, wodurch deren Kontrast erhöht wird.
• Niedrigster Preis – macht die Bildgebung bei Ratten und größeren Tieren erschwinglich. VivoVist ist konzentrierter als Konkurrenzprodukte, was bedeutet, dass für die Abbildung größerer Tiere weniger Einheiten benötigt werden. Weniger als zwei Fläschchen reichen aus, um einen guten Kontrast bei einer 250 g schweren Ratte zu erzielen.
• Geringe Toxizität (4 g/kg sind gut verträglich). VivoVist kann in höheren Dosen als Konkurrenzprodukte verabreicht werden, um einen superhohen Kontrast in feinen Strukturen zu erzeugen oder um die Beladung von Tumoren oder anderen interessanten Merkmalen zu beschleunigen.
• Niedrige Osmolalität, selbst bei hohen Konzentrationen. Das bedeutet, dass die Injektion von VivoVist die Elektrolytwerte im Kreislaufsystem nicht wesentlich verändert. Die Auswirkungen auf den Stoffwechsel, die Signalübertragung und andere Prozesse, die von der Aufrechterhaltung einer gleichmäßigen Ionenstärke abhängen, werden minimiert.
• Geringe Viskosität: einfache Injektion in kleine Mäuseschwanzvenenblutgefäße (typisches Injektionsvolumen 0,25 mL). VivoVist lässt sich leichter injizieren, verursacht weniger Traumata an der Injektionsstelle und kann schneller und in höherer Konzentration verabreicht werden als zähflüssigere Kontrastmittel wie Reagenzien auf Jodbasis.
• Es kann mit MicroCT-, klinischen CT-, planaren Röntgen- oder Mammographie-Geräten abgebildet werden. VivoVist ist für alle gängigen Computertomographen anpassbar und bietet dem Anwender die Flexibilität, Bilder in jeder gewünschten Gerätekonfiguration zu erstellen.
• Verbessert die Röntgendosis in der Strahlentherapie für Tumore und andere Ziele. Da VivoVist Röntgenstrahlen so stark absorbiert, erhöht es die lokale Röntgendosis. Wenn es auf Tumore oder andere therapeutische Ziele konzentriert wird, kann es eine Methode zur Verbesserung der Strahlentherapie und zur Steigerung der Wirksamkeit der Krebstherapie darstellen.

Maus (25 g) – guter Kontrast (1 g/kg VivoVist):

Kontrastmittel (Element)	Kontrastelement	Blut Halbwertszeit (Stunden)	Konzentration des Fläschchens (mg/ml)**	Eingespritzte Konzentration (mg/kg) (25 g Maus)	Injektionsvolumen (mL)
VivoVist	Erdalkalimetall	14	300	1000	0.08
Exitron Nano 12000	Erdalkalimetall	4	267	1000	0.09
Exitron P	Jod	~1	120	1000	0.25
Fenestra VC	Jod	~1	50	1000	0.50 (Injektionsvolumen sehr hoch)

Maus (25 g) – Superkontrast (3 g/kg VivoVist):

Kontrastmittel (Element)	Kontrastelement	Blut Halbwertszeit (Stunden)	Konzentration des Fläschchens (mg/ml)**	Eingespritzte Konzentration (mg/kg) (25 g Maus)	Injektionsvolumen (mL)
VivoVist	Erdalkalimetall	14	300	1000	0.08
Exitron Nano 12000	Erdalkalimetall	4	267	1000	0.09
Exitron P	Jod	~1	120	1000	0.25
Fenestra VC	Jod	~1	50	1000	0.50 (Injektionsvolumen sehr hoch)

Rat (250 g) – good contrast (0.54 g/kg VivoVist):

Kontrastmittel (Element)	Kontrastelement	Blut Halbwertszeit (Stunden)	Konzentration des Fläschchens (mg/ml)**	Eingespritzte Konzentration (mg/kg) (250 g Ratte)	Injektionsvolumen (mL)
VivoVist	Erdalkalimetall	14	300	540	0.45
Exitron Nano 12000	Erdalkalimetall	4	267	540	0.50

Auch in unserem Portfolio: Kollagen-hybridisierende in-vivo-Sonden.

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Das Verdünnungsverhältnis beschreibt eine einfache Verdünnung – eine Volumeneinheit des gelösten Stoffes (oder der Probe) wird mit einer gewünschten Volumeneinheit des Lösungsmittels (oder Verdünnungsmittels) kombiniert, um ein gewünschtes Gesamtvolumen zu erreichen (V_solute x V_solvent = Total V_solution).

Ein Verdünnungsverhältnis von 1:4 bedeutet also 1 Teil gelöster Stoff + 4 Teile Lösungsmittel = 5 Teile Gesamtvolumen. Die Summe aus dem gelösten Stoff und dem Lösungsmittel entspricht dem Gesamtvolumen.

Nützlich wird das Verständnis des Verdünnungsverhältnis und einer Verdünnungsreihe bei der Durchführung eines ELISA.

Allgemeines Verfahren zur Probenverdünnung

• Überprüfung der Literatur
  Ermitteln Sie den erwarteten Konzentrationsbereich in der Probe.
• Probe auf gewünschtes Volumen verdünnen
  Typischerweise ~2x die vorhergesagte Analytkonzentration in pg/ml
• Pilotversuch durchführen
  Serielle Verdünnung der Probe in eine volle Reihe auf einer Multi-Well-Platte (8 Wells auf einer 96-Well-Platte)
• Konzentration finden, die zu einer Sättigung des Signals führt (Sigmoidal Response)
  Die Daten werden normalerweise als optische Dichte (oder Fluoreszenz) gegen die Konzentration aufgetragen.
• Quantitativer Assay
  Vergleich der experimentellen Signale mit einer Standardkurve, die aus bekannten Konzentrationen erstellt wurde

So bereiten Sie eine serielle Verdünnung vor

Serielle Verdünnungen sind eine Reihe von Verdünnungen, die mit demselben Verdünnungsfaktor hergestellt werden. Sie werden häufig als Standardkonzentrationen (oder -mengen) für Quantifizierungstests verwendet. Die Verwendung desselben Verdünnungsfaktors über eine Reihe von Verdünnungen hinweg führt zu einer logarithmischen Abnahme der Konzentration der gelösten Stoffe über die Reihe hinweg. Die Standardkonzentrationen werden zur Erstellung einer Kalibrierungs- oder Standardkurve verwendet, die den Linearitätsbereich eines Assays abdeckt. Die Zielkonzentration oder -menge kann dann anhand dieser Kurve berechnet werden.

Gibt es einen Unterschied zwischen einem Verdünnungsverhältnis und einem Verdünnungsfaktor?

Ja, aber je nach Anwendung kann der Unterschied vernachlässigbar sein.

Der Verdünnungsfaktor beschreibt das Verhältnis zwischen dem Ausgangsvolumen des gelösten Stoffes und dem Gesamtvolumen der verdünnten Lösung (V_solute x V_solvent = Total V_solution).

Verdünnungsfaktoren sind von besonderer Bedeutung bei der Durchführung von Serienverdünnungen.

So beschreibt ein Verdünnungsfaktor von 1:4, dass 1 Teil gelöster Stoff in 4 Teilen Lösungsmittel = 4 Gesamtteile gelöst ist. Das Produkt aus gelöstem Stoff mal Lösungsmittel ist gleich dem Gesamtvolumen.

In den Kontext gestellt

Die Zweideutigkeit zwischen den beiden Begriffen ergibt sich aus der Konvention, beide als Verhältnis darzustellen. Mit anderen Worten, wenn man verschiedene Personen bittet, eine 1:2-Verdünnung durchzuführen, erhält man unterschiedliche Ergebnisse als wenn man bittet, eine Probe um die Hälfte zu verdünnen. In der Literatur und in Lehrbüchern werden beide Verhältnisse üblicherweise als 1:2 angegeben. Streng genommen wird eine Verdünnung als Teile über Teile ausgedrückt, um zu differenzieren, in diesem Beispiel ½, oder als Exponent.

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Funktionsweise des Bone Resorption Activity Assay Kit

Das Bone Resorption Assay Kit nutzt fluoreszierendes Calciumphosphat (CaP) als Substrat für die zelluläre Knochenresorptionsaktivität. Die Kulturplatten (in den Kits enthalten und auch separat erhältlich) sind mit einem synthetischen kristallinen Karbonat-Apatit vorbeschichtet, einer einheitlichen und definierten Alternative zu natürlichem Apatit in Dentinscheiben.

Vor der Verwendung werden die CaP-beschichteten Platten frisch an mit Fluoresceinamin markiertes Chondroitinsulfat gebunden (in den Kits enthalten und auch separat erhältlich). Durch die osteoklastische Resorptionsaktivität wird das markierte Chondroitinsulfat aus dem plattengebundenen Calciumphosphat freigesetzt. Das freigesetzte markierte Chondroitinsulfat wird durch einfache fluorometrische Auswertung der Fluoreszenzintensität quantifiziert.

Dieses Kit ermöglicht auch die parallele Durchführung des langsameren, arbeitsintensiveren, aber traditionellen Pit-Assays. Es ist anzumerken, dass CosmoBio CaP-vorbeschichtete Platten mit Trans-Well-Einsätzen in zellulären Co-Kultur-Versuchsplänen verwendet wurden (Heo, S. C. et al. Int J Mol Sci 22, 695 (2021) und Steller, D., Scheibert, A., Sturmheit, T. & Hakim, S. G. Sci Rep-uk 10, 16861 (2020)).

Merkmale des Kits

• Der zeitliche Verlauf der Knochenresorptionsaktivität lässt sich leicht durch Messung der Fluoreszenz der Kulturmediumprobe ermitteln.
• Bewährte Methode, die von Forschern weltweit eingesetzt wird. Keine Bildgebung erforderlich.
• Praktische, mit CaP (Hydroxylapatit) vorbeschichtete Vertiefungen, die sich in der Vertiefung nicht bewegen.
• Gebrauchsfertige, sterile Komponenten.
• Fluoreszenzanregungs- und -emissionswellenlängen identisch mit FITC. HINWEIS: Kulturmedien ohne Phenolrot verwenden.
• Ermöglicht die mikroskopische Beobachtung der Zellmorphologie.
• Ermöglicht die Bestimmung der Grubenfläche nach der Zellentfernung * mit Hilfe einer Bildanalysesoftware.
• Geeignet für die Bewertung der Reaktion von Osteoklasten auf Medikamente wie Bisphosphonate.

Das Bone Resorption Activity Assay Kit wird oft zitiert

Seit seiner Markteinführung hat das Bone Resorption Assay Kit kontinuierlich über 117 Zitierungen erhalten, davon 10 in der ersten Hälfte des Jahres 2021. Das Bone Resorption Assay Kit von CosmoBio ist somit eine gut etablierte und zuverlässige kommerzielle Lösung, auf die sich Forscher, die den Knochenstoffwechsel untersuchen, verlassen.

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Antikörper werden von B-Zellen produziert

Bevor wir uns mit den nachweisbaren Antikörpern befassen, sollten wir uns etwas Hintergrundwissen aneignen. Antikörper werden von spezialisierten weißen Blutkörperchen, den B-Lymphozyten oder B-Zellen, produziert. Wenn unser Immunsystem auf eine fremde Substanz wie ein Virus oder eine Bakterie stößt, treten die B-Zellen in Aktion. Sie produzieren Antikörper, die sich an bestimmte Antigene auf der Oberfläche dieser Eindringlinge binden und sie so zur Vernichtung markieren.

Wichtige Trends und Entwicklungen:

Im Laufe der Jahre haben Wissenschaftler erhebliche Fortschritte beim Verständnis und der Identifizierung der verschiedenen im Blut vorhandenen Antikörper gemacht. Technologische Fortschritte bei den Methoden zum Nachweis von Antikörpern, wie z. B. der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) und die Durchflusszytometrie, haben die Diagnostik und Forschung revolutioniert. Diese Instrumente ermöglichen es Wissenschaftlern, Antikörper mit Präzision und Genauigkeit nachzuweisen und zu messen.

IgM-Antikörper: Die frühen Antwortgeber

Wenn eine Infektion oder eine Impfung auftritt, produziert das Immunsystem rasch IgM-Antikörper als erste Verteidigungslinie. IgM-Antikörper sind groß und können Krankheitserreger wirksam neutralisieren. Sie dienen als frühzeitiger Hinweis auf eine laufende Immunreaktion und sind daher für die Diagnose von akuten Infektionen von entscheidender Bedeutung.

IgG-Antikörper: Die Wächter der Langzeitimmunität

IgG-Antikörper, die am häufigsten im Blut vorkommende Klasse, sorgen für eine lang anhaltende Immunität gegen Krankheitserreger. Diese Antikörper werden nach der anfänglichen IgM-Reaktion gebildet und bleiben über einen längeren Zeitraum erhöht. IgG-Antikörper spielen eine entscheidende Rolle beim Impfschutz, da sie bei einer erneuten Infektion spezifische Erreger erkennen und neutralisieren können.

IgA-Antikörper: Stille Beschützer an Schleimhautoberflächen

Während IgM- und IgG-Antikörper hauptsächlich im Blut zirkulieren, sind IgA-Antikörper auf den Schutz von Schleimhautoberflächen wie den Atemwegen und dem Magen-Darm-Trakt spezialisiert. Sie wirken wie eine Barriere und verhindern, dass Krankheitserreger über diese empfindlichen Stellen in den Körper gelangen. Die Messung von IgA-Antikörpern hilft bei der Bewertung der Immunreaktion an diesen wichtigen Stellen.

IgE-Antikörper: Die Übeltäter hinter Allergien

Im Gegensatz zu den vorherigen Antikörperklassen werden IgE-Antikörper mit allergischen Reaktionen in Verbindung gebracht. Wenn das Immunsystem harmlose Substanzen wie Pollen oder bestimmte Nahrungsmittel fälschlicherweise als Bedrohung erkennt, löst es eine allergische Reaktion aus. IgE-Antikörper heften sich an bestimmte Zellen und setzen Chemikalien frei, was zu Symptomen wie Juckreiz, Niesen oder Nesselsucht führt.

Monoklonale Antikörper: Präzisionswerkzeuge für therapeutische Anwendungen

Monoklonale Antikörper sind im Labor hergestellte Versionen von natürlichen Antikörpern. Sie sind auf bestimmte Moleküle oder Zellen im Körper ausgerichtet und werden für verschiedene therapeutische Anwendungen eingesetzt, z. B. zur Behandlung von Krebs, Autoimmunerkrankungen und Infektionskrankheiten. Diese Präzisionsinstrumente sind vielversprechend für die personalisierte Medizin und gezielte Therapien.

Antikörpertests

Regelmäßige Kontrolluntersuchungen: Planen Sie Routineuntersuchungen ein, die auch Antikörpertests umfassen, um Ihren Immunstatus zu beurteilen und mögliche Grunderkrankungen zu erkennen.
Bleiben Sie auf dem Laufenden: Bleiben Sie auf dem Laufenden über die neuesten Forschungsergebnisse und Fortschritte bei den Antikörpernachweisverfahren, da diese wertvolle Erkenntnisse über Ihre Gesundheit und Ihr Wohlbefinden liefern können.
Befolgen Sie die Impfrichtlinien: Verstehen Sie die Rolle nachweisbarer Antikörper für die Wirksamkeit von Impfstoffen. Halten Sie sich an die empfohlenen Impfpläne und besprechen Sie etwaige Bedenken mit Ihrem medizinischen Betreuer.

Antikörperspiegel allein vermitteln kein umfassendes Bild der Immunität

Der Nachweis von Antikörpern ist zwar ein wertvolles Instrument für die Diagnose von Infektionen und die Bewertung von Immunreaktionen, doch darf nicht vergessen werden, dass Antikörperspiegel allein kein umfassendes Bild der Immunität vermitteln. Andere Komponenten des Immunsystems, wie z. B. die T-Zellen, spielen ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Abwehr von Krankheitserregern. Darüber hinaus können die Antikörperspiegel von Person zu Person variieren, und bei bestimmten Krankheiten kann es zu atypischen Antikörperreaktionen kommen.

IgM, IgG, IgA und IgE sind im menschlichen Blut nachweisbar

Antikörper sind bemerkenswerte Bestandteile unseres Immunsystems, die uns vor schädlichen Krankheitserregern schützen. Die in unserem Blut nachweisbaren Antikörper, darunter IgM, IgG, IgA und IgE, liefern wertvolle Erkenntnisse über Immunreaktionen, Krankheitsdiagnosen und die Wirksamkeit von Impfstoffen. Wenn wir die verschiedenen Funktionen dieser Antikörper verstehen, können wir die Feinheiten unseres Immunsystems besser einschätzen und fundierte Entscheidungen für unsere Gesundheit treffen.

Wenn Sie also das nächste Mal von Antikörpertests hören oder über Impfungen sprechen, denken Sie an die bemerkenswerte Welt der nachweisbaren Antikörper in Ihrem Blut und an die entscheidende Rolle, die sie für den Schutz Ihrer Gesundheit spielen.

Wir hoffen, dass dieser Blogbeitrag Ihre Neugierde geweckt und Ihnen ein tieferes Verständnis für die im Blut nachweisbaren Antikörper vermittelt hat. Teilen Sie uns Ihre Gedanken, Erfahrungen oder zusätzliche Fragen in den Kommentaren mit, die Sie unten finden.

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Um Ihnen die Entscheidung zu erleichtern, ob Säugetierexpressionssysteme die Antwort auf Ihre Probleme sind, haben wir wichtige Informationen über ihre Vorteile und Leitprinzipien zusammengestellt.

Was ist zellbasierte Expression bei Säugetieren?

Die Expressionsplattform, die die am besten organisierten und funktionellen Säugetierproteine hervorbringt, ist das Wirtssystem von Säugetieren. Die Expression in Säugetieren ist die Technik der Wahl, um die Funktion eines bestimmten Proteins in einem physiologisch relevanten Kontext zu untersuchen, da sie den größten Anteil an posttranslationaler Verarbeitung und funktioneller Aktivität des Proteins aufweist.

Mit diesem Ansatz werden therapeutische Proteine, Antikörper und Proteine in funktionellen zellbasierten Assays erzeugt.

Expressionssysteme für Säugetierzellen

Die ideale Methode zur Herstellung eukaryotischer Proteine sind Zellexpressionssysteme, vor allem wenn eine korrekte Faltung und posttranslationale Modifikationen (Glykosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung usw.) erforderlich sind. Sie erzeugen rekombinante eukaryotische Proteine in ihrer reinen Form mit ihrer ursprünglichen Tertiärstruktur, ihren physikochemischen Eigenschaften und ihrer biologischen Aktivität.

Diese Technologie wurde zur Expression komplexer, veränderter, funktioneller Proteine und Antikörper sowie sekretierter oder Membranproteine wie rekombinante Glykoproteine (Enzyme und Impfstoffe), Hormone, monoklonale Antikörper und Zytokine eingesetzt. Säugetierzellen werden aus tierischem Gewebe entnommen oder isoliert.

Der endgültige Leitfaden für Expressionssysteme auf der Basis von Säugetierzellen

Tierische Zellen werden seit kurzem zur Herstellung von Viren, Virusuntereinheiten, Antikörpern, rekombinanten Proteinen und Vektoren für die Gentherapie genutzt. Säugetierzellsysteme werden nicht nur in der kommerziellen Biotechnologie eingesetzt, sondern auch zur Erforschung der wichtigsten Aspekte der posttranslationalen Proteinverarbeitung, der Transkription, der Translation und der Genreplikation verwendet.

Wesentliche Aspekte der Genaktivität von Säugetieren können heute dank der Verfügbarkeit von Zellen, die transformiert werden können, und auf Viren und Plasmiden basierenden Vektorsystemen für Säugetierzellen untersucht werden. Expressionssysteme für Säugetierzellen werden in der Regel für folgende Zwecke verwendet:

• Bestätigung eines Genprodukts aus einem Klon.
• Untersuchung, wie die Proteinexpression in Säugetierzellen die Zellphysiologie beeinflusst.
• Herstellung von cDNA-Bibliotheken und Isolierung von Genen.
• Sie stellen geeignete Proteine mit Faltung und Glykosylierung her, um biologische Aktivitäten sowohl in vitro als auch in vivo zu bewerten.
• Wir stellen genügend Proteine und Glykoproteine her, um den strukturellen Aufbau der Protein- und Nährstoffeinheiten zu charakterisieren.
• Die Produktion von therapeutischen Proteinen wie Interferon, Gewebeplasminogenaktivator, Erythropoietin und Faktor VIII sowie von therapeutisch wichtigen Antigenen auf der Oberfläche von Viren wie dem Oberflächenantigen des Perihepatitis-B-Virus ist ebenfalls von wesentlicher Bedeutung.
• Die Herstellung monoklonaler Antikörper ist die Nummer sieben.

Säugetierzellen besitzen mehrere entscheidende Eigenschaften, wie die Fähigkeit, posttranslationale Veränderungen vorzunehmen und entsprechend gefaltete Glykoproteine mit terminaler Sialinsäure und komplexen antennären Oligosacchariden freizusetzen. Diese kovalenten Modifikationen können sich auf die therapeutische Wirksamkeit des Proteins auswirken (z. B. auf die Halbwertszeit im Blutkreislauf und die Biospezifität), oder sie können Merkmale liefern, die für die biochemische Charakterisierung hilfreich sind (z. B. strukturelle Stabilität, funktionelle Gruppen und biologische Rolle).

Durch die selektive Hemmung des Eintritts falsch gefalteter, falsch zusammengesetzter und unvollständig gebildeter Proteine in den sekretorischen Weg werden Säugetierproteine unter Qualitätskontrolle produziert. Das Material, das ausreichend verdaut wurde, wird weiterverarbeitet und normalerweise als voll funktionsfähiges Protein freigesetzt.

Die Fähigkeit von Säugetierzellen, Proteine mit Sialylglykoformen zu exprimieren, die den vom Menschen hergestellten Glykoproteinen sehr ähnlich sind, ist ein weiterer wichtiger Aspekt dieser Fähigkeit. Im Gegensatz dazu erzeugen Hefen häufig eine Hyper-Mannose-Glykosylierung, und E. coli verfügt über keinerlei Glykosylierungsmechanismus.

Die Leber entfernt die von der Hefe erzeugten Glykoproteine schnell aus dem Blutkreislauf, was beim Menschen ebenfalls negative immunogene Reaktionen hervorrufen kann. Der korrekte Zusammenbau multimerer Proteine kann ebenfalls verändert werden, ebenso wie die Carboxylierung von Glutaminsäureresten, die Hydroxylierung von Asparagin- und Asparaginresten, die Sulfatierung von Tyrosinresten, die Phosphorylierung von Proteinen über die Zellrezeptor-Protein-Interaktion, die Acylierung von Fettsäuren und die Phosphorylierung von Proteinen.

Säugetierzellen führen posttranslationale Veränderungen wie Glykosylierung, Kohlenhydrattrimming und proteolytische Propeptidverarbeitung durch. In E. coli führt die Herstellung von rekombinanten Proteinen, die in den Zellen produziert werden, zum Aufbau der reduzierten Form des Proteins, häufig als refraktile unlösliche Aggregate, die im Gegensatz zu Säugetierzellen weiter denaturiert und erneut gefaltet werden müssen.

Wann sollte man sich für Expressionssysteme auf der Basis von Säugetierzellen entscheiden, um rekombinante Proteine zu exprimieren?

Die besten Expressionssysteme für große Proteine mit komplizierten nativen Strukturen und Aktivitäten sind jene, die auf Säugetierzellen basieren. Säugetierzellen sind den kleineren eukaryotischen oder bakteriellen Systemen überlegen:

• Faltung eines Proteins
• Veränderung nach der Übersetzung (wie beim Menschen)
• bieten unglaublich hohe Proteinausbeuten
• verfügen über sehr effektive Mechanismen zur Proteinsekretion, die eine kostengünstige und hochreine Proteinreinigung ermöglichen
• gewährleisten eine verbesserte Einheitlichkeit von Charge zu Charge bei gleichzeitiger Einhaltung der entscheidenden Qualitätsnormen für die Herstellung therapeutischer Proteine
• Ermöglicht unterschiedliche Zelllinien und Methoden (z. B. instabil versus transient)

Aufgrund dieser Eigenschaften werden derzeit für die Herstellung der meisten auf dem Markt erhältlichen therapeutischen Proteine ertragreiche Säugetierzelllinien wie CHO-Zellen (Chinese Hamster Ovary) verwendet. Diese Zellen haben sich so entwickelt, dass sie in spezifischen chemischen Umgebungen ohne tierische Produkte gedeihen.

Außerdem bieten sie Kulturbedingungen mit hoher Dichte, die die Ausbeute erhöhen, während das Kulturvolumen gering bleibt. Säugetiersysteme produzieren eine große Anzahl von Proteinen außerhalb des medizinischen Bereichs. Die primären nicht-therapeutischen Anwendungen betreffen die strukturelle und funktionelle Analyse menschlicher oder tierischer Proteine, die für die Grundlagenforschung und die klinische Forschung unerlässlich sind.

Diese Systeme können auch Enzyme oder andere funktionelle Proteine für analytische und wissenschaftliche Zwecke herstellen. Darüber hinaus können Säugetierzellen diese Aufgabe übernehmen, wenn rekombinante Proteine aus Nicht-Säugetieren mit anderen Expressionsmethoden nicht hergestellt werden können.

Säugetierzellen als Wirt der Wahl

Obwohl viele Wirte von Säugetierzellen Proteine produzieren können, haben sich nur einige wenige als Optionen für die Herstellung von Proteinen durchgesetzt, die in klinischen Anwendungen eingesetzt werden. Die Notwendigkeit von Zelllinien, die:

• Kann kontinuierlich wachsen
• Möglichkeit des Suspensionswachstums (in Bioreaktoren)
• minimales Risiko einer zufälligen Infektion mit Viren, die schädlich sein könnten
• Sie haben genetische Stabilität
• Einfache Charakterisierung hinsichtlich der Isoenzyme, der Anzahl der Genkopien, der Morphologie und der Karyologie

Der potenzielle Nutzer muss eine Expressionsstrategie festlegen, die auf den Endzielen basiert, da es mehrere Wirtszellsysteme, verfügbare virale oder cDNA-basierte Vektoren und die Möglichkeit einer stabilen oder vorübergehenden Expression gibt.

Bei der vorübergehenden Expression kommt es in der Wirtszelle zu einer Spitze in der Proteinproduktion, auf die in der Regel eine schnelle Lyse und der Tod der Zelle folgen. Dadurch ergibt sich das Problem der Isolierung des gewünschten Proteins aus einem Gemisch von Nukleinsäuren, lysiertem Zellprotein und Viruspartikeln, das eine Konzentration von 5 g/ml haben kann.

Aufgrund des geringen Titers und der anfänglichen Reinheit kann die Produktausbeute bei der Reinigung minimal sein; wenn jedoch nur geringe Proteinmengen benötigt werden, ist das Vaccinia-System oder die transiente Expression in COS-Zellen eine schnelle und akzeptable Technologie. Da es schwierig ist, die transiente Expression in ein Bioreaktorsystem zu übertragen, müssen bei einer regulären Expression größere Proteinmengen produziert werden.

Einige wenige Zelllinien wurden bereits erfolgreich als Wirte für die Herstellung nützlicher Proteine und Viren eingesetzt. Dazu gehören die normale embryonale Zelllinie WI-38 und die menschliche embryonale Lungenzelllinie MRC-5. Diese Zellen haben eine auf ein halbes Jahrhundert begrenzte Lebenszeit, bevor sie zu altern beginnen und zugrunde gehen. Ihr Anheftungswachstum ist abhängig.

Zelllinien, die einer viralen Transformation oder Chromosomenmutation unterzogen wurden, können sowohl die Fähigkeit zu unbegrenztem Wachstum als auch die Fähigkeit zum Wachstum in Suspension besitzen. HeLa- und Namalwa-Zellen aus menschlichen Lymphomen bzw. Gebärmutterhalskrebs sind zwei Beispiele für solche Zelllinien. Die Möglichkeit, dass tumorerzeugende Agenzien auf das Endprodukt übertragen werden, hat zu einer gewissen Zurückhaltung bei der Verwendung dieser Zelllinien für die Entwicklung therapeutischer Arzneimittel geführt.

Zur Herstellung größerer Mengen rekombinanter Proteine ist eine stabile Expression erforderlich, die in der Regel in Myelomzellen (z. B. NS/O), Baby-Hamster-Nieren-Zellen (BHK-21) oder CHO-Zellen durchgeführt wird. Diese Zelllinien haben eine unendliche Kapazität für eine groß angelegte Expansion und sind gute Wirte für den stetigen Einbau heterologer DNA.

Vorübergehende oder stabile Ausprägung?

Ein Protein kann in zellbasierten Systemen von Säugetieren entweder vorübergehend oder dauerhaft exprimiert werden. Beide Strategien haben Vor- und Nachteile. Sie können daher in verschiedenen Phasen des Proteinsyntheseprozesses oder für verschiedene Anwendungen eingesetzt werden.

Säugetierzellen können DNA-Vektoren nicht getrennt von ihrem Genom replizieren, da sie nicht in der Lage sind, die Replikationsursprünge von Plasmiden zu identifizieren, was für andere Expressionssysteme charakteristisch ist. Diese Einschränkung führte zur Schaffung von instabilen und transienten Systemen.

Die erste Art von Systemen macht sich die langen Zellzyklen von Säugetierorganismen zunutze, um die Expression rekombinanter Proteine in Säugetierzellen für kurze Zeit zu ermöglichen. Der Expressionsvektor wird in der Regel in großer Zahl in diese Systeme transfiziert, geht aber nach einigen Zellteilungen wieder verloren.

Einer der Hauptvorteile dieser Systeme sind die kurzen Durchlaufzeiten und die hohe Ausbeute. Aufgrund dieser Eigenschaften sind sie äußerst nützlich für Anwendungen wie das Screening von Medikamenten und Proteinvarianten sowie für die Forschung.

Wenn Sie einen Service für die Proteinexpression suchen, ist Biomatik hier, um Wissenschaft zugänglich und kostengünstig zu machen, indem wir hochwertige integrierte Produkte und Dienstleistungen für die biowissenschaftliche Forschung und Arzneimittelentwicklung anbieten. Biomatik unterstützt diejenigen, die Medikamente erforschen und entwickeln, von weit verbreiteten Bioreagenzien und ELISA-Kits bis hin zu spezialisierten Herstellungsdiensten, einschließlich Antikörper-Sequenzierungsdiensten, Gensynthese, Antikörperproduktion und Peptidsynthese.

Im Gegensatz dazu ist eine reguläre Expression ein langwieriges Verfahren, bei dem der DNA-Vektor dauerhaft in das Genom des Säugetiersystems eingebaut werden muss. Nach der Transfektion müssen einzelne positive Klone ausgewählt und isoliert werden, da diese Integration ortsgebunden oder zufällig sein kann. Die Phase, die am längsten dauert, das Einzelklon-Screening, kann in der Regel bis zu 4 Monate dauern.

Es wird häufig mit manuellen Techniken wie der reduzierenden Verdünnung oder automatisierten Verfahren wie VIPSTM (verified in-situ plate seeding) durchgeführt. Diese Technologie kann für die biopharmazeutische Produktion in großem Maßstab eingesetzt werden, da es Zeit braucht, stabile Zelllinien zu erzeugen.

Anforderungen an das Expressionssystem für Säugetiere

Wie effektiv ein Gen transkribiert wird, hat einen entscheidenden Einfluss darauf, wie stark es exprimiert wird. Jedes Gen kann transkribiert werden, wenn der RNA-Polymerase-Komplex an die Promotorregionen bindet und sich von 5 nach 3 entlang des Gens fortbewegt. Dadurch entsteht ein RNA-Transkript, das sich schließlich am Transkriptionssignal vom Gen trennt und das Transkript in Vorbereitung auf eine eventuelle Translation einfriert.

Für die Genexpression in Säugetierzellen sind eine geeignete Zelllinie und die richtigen Vektoren erforderlich. Die Vektoren sollten dazu dienen, das gewünschte Gen in die erforderlichen Zelllinien zu bringen.

Zelllinien als Expressionssysteme

Aus Säugetierzellen hergestellte Proteintherapien haben in den letzten zehn Jahren das Gesicht der menschlichen Gesundheitsversorgung verändert. Die Bedeutung von Proteintherapien hat die Suche nach effizienteren und kostengünstigeren Zelllinien, die hochwertige Proteinprodukte herstellen können, vorangetrieben.

Virale Impfstoffe, diagnostische Tests und therapeutische Proteine wurden in der Vergangenheit mit Bioprozessen auf der Basis von Säugetierzellen hergestellt. Zellen dienen als Wirt für die Herstellung von Proteinen in Proteintherapien.

Vektoren

DNA-Moleküle, die sich unabhängig voneinander replizieren und als Vektoren fungieren, können fremde DNA-Fragmente transportieren. Es ist ein Werkzeug für das Klonen von Genen. Ein geeigneter Vektor wird zunächst verwendet, um die gewünschte DNA zu klonen. Anschließend kann das gewünschte Gen transfiziert und im Wirt exprimiert werden. Am häufigsten werden Vektoren aus Säugetierviren hergestellt, die heterologe Gene in Säugetierzellen exprimieren.

Dazu gehören Herpesviren, Polyomaviren, Papoviren und Simian Viruses 40 (SV40). Die Wahl eines wirksamen Promotors und eines Selektionsmarkers ist für die Konstruktion des Vektors erforderlich.

Unterm Strich

Auf Säugetierzellen basierende Expressionssysteme für rekombinante Proteine können eine geeignete Proteinfaltung und posttranslationale Modifikationen bewirken, die häufig für eine vollständige biologische Aktivität erforderlich sind. In erster Linie bietet der Artikel einen prägnanten Überblick über die jüngsten Entwicklungen bei Säugetier-Expressionssystemen, die für die Tierbiotechnologie von Bedeutung sind.

Mehr als die Hälfte der heute auf dem Markt befindlichen biopharmazeutischen Produkte und Hunderte weiterer Kandidaten in der klinischen Entwicklung werden durch die Expression von Säugetierproteinen hergestellt, die sich in den letzten zwei Jahrzehnten zur vorherrschenden Technik der rekombinanten Proteinproduktion für therapeutische Zwecke entwickelt hat.

Es wurden neue Strategien zur Genexpression, zum Gen-Silencing und zum Gen-Targeting eingeführt, und es wurden bedeutende Erfolge bei der Schaffung und Entwicklung neuer Zelllinien erzielt. Nur wenn die Produktivität, die Bioaktivität, die Funktion und die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Zielproteins zusammen mit den Kosten, der Praktikabilität und der Sicherheit des Systems selbst berücksichtigt werden, kann die beste Expressionsmethode gewählt werden.

Die Suche nach weiteren Säugetierzelllinien, Vektorsystemen und Genexpressionstechnologien ist notwendig, um effektivere Proteine mit hoher biologischer Aktivität herzustellen.

Lesen Sie mehr über zellfreie Expressionssysteme.

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